目  录

1. 红色荧光蛋白色素

2. 红色荧光蛋白色素突变

3. 颜色转变时间表

4. 酸碱度对红色荧光蛋白的荧光性及表现色的影响

5. 金属对红色荧光蛋白荧光性的荧光淬火效果

6. 增加红色荧光蛋白荧光性的金属

7. 对红色荧光蛋白荧光性无影响的金属

8. 颜色混合

9. 红色荧光蛋白——红色荧光色素583

10. 红色荧光色素561

11. 红色荧光色素572

12. 其他蔷薇珊瑚的色素

13. 一个蔷薇类珊瑚的绿变红光电转换案例

14. 红色荧光色素576

15. 红色荧光色素593

16. 红色荧光色素597

17. 红色荧光色素611

18. 其他可能为红色荧光蛋白类的色素

19. 红色荧光色素620

20. 红色荧光色素620

21. 红色荧光色素630

22. 评论

23. 鸣谢

24. 参考文献

在这个系列文章的第一(http://www.advancedaquarist.com/2009/1/aafeature1)和第二(http://www.advancedaquarist.com/2009/2/aafeature1)部分中，我们评论了有关青色和绿色荧光色素的信息，众所周知的诱发珊瑚和海葵里这些颜色的因素以及光电转换案例。很显然，色素沉着的各种结果及对各种外界刺激的反应是复杂的。然而，对我们理解刺胞动物着色上有巨大帮助。这个月，我们来看看红色荧光蛋白类中的几种橙色和红色色素。如果一些术语看着陌生，相关的术语汇编请参见上面两个链接中的任一个。

迄今为止，我们知道的所有鹿角类SPS的红色荧光色几乎全部来自于红色荧光型蛋白的C3分支类型。

照片来自于Justin Miedwig和madfragsonline.com网站

这篇文章的目的是将零七八碎的信息缝合成便于爱好者们使用的形式，不仅让他们会诱发和保持色度，还辅助理解究竟为何会产生这些颜色。对诸如光和酸碱度这样的外界刺激，红色荧光蛋白类色素会做出相同的反应吗？或者说这些外界刺激是必要的吗？如果不是，那为什么？“微量元素”的潜在影响是什么？如果你对此关注且感兴趣请继续往下读。

红色荧光蛋白色素

红色荧光蛋白（全称：来源于香菇珊瑚的红色荧光蛋白）是五大色素种类之一。红色荧光蛋白最初从拟珊瑚海葵目中的香菇珊瑚分离而来，目前我们知道它还存在于纽扣珊瑚，石珊瑚和海葵中（见表1）。荧光发射范围从橙色（561纳米）到红色（620纳米）；但要注意的是带绿色的红色荧光蛋白发色团也包含在内。人们一般认为“原始的”红色荧光蛋白的荧光发射值为583纳米（处于可见光谱的橙色或红色部分）。

红色荧光蛋白突变

在荧光蛋白质中DsFP483(Ds代表宿主“珊瑚”香菇珊瑚；FP代表荧光蛋白；483代表483纳米——是青色光谱中色素荧光性的峰值）只有两种氨基酸替代物质（处于包含着上百种氨基酸的一种蛋白质中），因此与红色光谱中的荧光峰值在化学上有所不同。但这些氨基酸替代物质有深刻的影响力，并且青色色素FP483还达不到红色的要求。对红色荧光蛋白发色团结构的其他轻微改良可使发射荧光的色素比未经改良的野生型的红色荧光蛋白更红。改良的红色荧光蛋白有极大的荧光发射值，分别是592纳米、594纳米、600纳米和602纳米。因此，我们可以轻松看见由极微小的突变所呈现出的十分不同的光谱特性。我们在检测其他红色荧光蛋白质的荧光性时要牢记这一点（应该是峰值不同这点吧）。

注意许多红色荧光蛋白突变色素都存在着激发、发射、从绿色到红色的不同的转变速度的不同以及完全成熟色素的绿红比问题。表1列出了实验室中一些红色荧光蛋白色素的基因工程（看到这些在自然界中看不见的色素，借这样一个好机会我们的确有了化学成分细小变化影响的概念。）

表1. 红色荧光蛋白发色团的化学成分的微小变化可产生极其不同的着色视觉感，色素也从绿向红快速成熟。（数据）来源于贝尔德等人，2000年.

突变	红色发射值	成熟速度 (两天后)
野生种红色荧光蛋白 (未突变)	583	~红色荧光性增加40倍
K83R	582	变化很小
K83E	584	变化很小
K83N	592	增加2-5倍
K83P	594	增加2-5倍
K83F	594	变化很小
K83W	594	增加2-5倍
K83M	602	变化很小
Y120H	600	增加2-5倍
5197T	584	增加5-20倍
K70R	585	增加5-20倍

颜色转变时间表

贝尔德等人（2000年）报告称较之红色荧光蛋白的变化绿色色素前体物的转变相对缓慢些（一两天），且不需要光能促发。然而，其他研究者通过对各种波长曝光已展现出该色素的颜色转变。从红到“血红”的转变是发生曝光的结果。

酸碱度对红色荧光蛋白的荧光性及表现色的影响

贝尔德等人（2000年）声称红色荧光蛋白（来源于香菇珊瑚）的荧光发射对超过4.5-12范围的酸碱度无感，并且对处于或接近～8.8的酸碱度有高量子产额。不过，既然吸收（激发）峰值由酸碱度调制而来——当酸碱度变得更低时，波长吸收峰值从558纳米降至526纳米，可以想象在珊瑚组织内的酸碱度转换可以导致感色上的变化。

金属对红色荧光蛋白荧光性的荧光淬火效果

老鸟们都知道对海洋无脊椎动物来说铜是有毒的，并避免给珊瑚缸里的鱼使用含铜的药品。但是，微量的铜(铜离子和亚铜离子处于十亿分之几的范围）可以与野生型红色荧光蛋白质结合并抑制一些能量突变，压制（抑制或停止）荧光性（拉希米等人，2008）。幸运地是影响是可逆的，加入螯合剂可产生相反的效果并恢复荧光性。随着酸碱度的增加这一淬火效果变得更加显著。

其他研究者通过钴和镍还发现了金属诱导荧光淬火的证据（虽然没有达到铜的程度——伊莱和Chakrabartty，2006）。我们注意到锌可以降低一些绿色基因工程荧光蛋白质的荧光性（但我们不知道是那种绿色荧光蛋白）但不能降低红色荧光蛋白的荧光性。见图1（注意该信息只适用于红色荧光蛋白色素，不适用其突变色素）。

增加红色荧光蛋白荧光性的金属

有意思地是，一些重金被发现可以少量增加香菇珊瑚中蛋白质的荧光性。最具效果的那些金属有（按降序排列）：锰、铁、铬（伊莱和Chakrabartty, 2006）。见图1.

对红色荧光蛋白荧光性无影响的金属

金属及他们对红色荧光蛋白荧光性的影响近来已成为研究者们感兴趣的课题——并非他们不在乎漂亮的颜色，而是他们对量化金属的荧光“淬火”效果更感兴趣，目的是为了研究诸如老年痴呆症及其他一些疾病。2006年伊莱和Chakrabartty研究了大量的金属以及他们对红色蛋白荧光性的影响。那些没有显示出影响的金属离子是钠离子（Na+）、钾离子（K+）、钙离子（Ca²⁺）和镁离子（Mg²⁺）。后面的很有趣，因为来自我尊敬的业余爱好者们的网络报告中声称低量镁离子可导致一些蔷薇珊瑚样本褪色。见图1.

图1. 一些金属阻止（抑制）了红色荧光蛋白色素的荧光性，他们是铜、钴和镍，而其他的（铬、铁和锰）则增加了荧光性。另一些金属对荧光性没有影响（钙、镁、钾、钠和锌）。根据伊莱和Chakrabartty2006年的研究。

颜色混合

不同波长下荧光峰值的组合会欺骗眼睛看到一种并不存在的颜色。就红色荧光蛋白而言，研究者们已经注意到由颜色混合产生的一种表现色（非真实的）为黄色的着色。

众所周知所有的色素类群（A-D)都至少包含一种红色荧光蛋白类的颜色。见表2.

图2. 一种香菇珊瑚呈现着它出名的红色荧光。图片由作者提供

表2. 红色荧光蛋白色素至少包含5个类群（A,B,C1,C3和D）。这个列表不包括非荧光的红色荧光蛋白的色素蛋白（这些以后再做调查）

物种	色素名称	种类	亚目	激发值	发射值	类群
Echinopora forskaliana	eforCP/RFP	DsRed	Faviina	589	609	?
Acropora millepora	amilRFP	DsRed	Astrocoeiina	560	593	C3
Acropora millepora	amilFP597	DsRed	Astrocoeiina	558	597	?
Discosoma sp.	DsRed	DsRed	Corallimorpharia	558	583	B
Discosoma sp.	dis2RFP	DsRed	Corallimorpharia	558	593	D
Entacmaea quadricolor	eqFP611	DsRed	Actinaria	559	611	A
Fungia concinna	Kusabira-Orange	DsRed	Fungiina	548	561	C1
Montipora digitata	mdigFP572	DsRed	Astrocoeiina	556	572	?
Montipora efflorescens	meffRFP	DsRed	Astrocoeiina	560	576	C3
Montipora sp.	Keima-Red	DsRed	Astrocoeiina	440	620	B
Porites porites	pPorRFP	DsRed	Faviina	578	595	B
Zoanthid sp.	Zoan2RFP	DsRed	Zoanthidae	506	574	C3
Zoanthid sp.	Zoan2RFP	DsRed	Zoanthidae	552	576	C*
Zoanthus sp.	zoanGFP	DsRed	Zoanthidae	496	506	C3

红色荧光蛋白——红色荧光色素583

宿主：香菇珊瑚种

色素类群：B

色素种类：红色荧光蛋白

激发值/发射值：分别为558纳米/583纳米

包含的荧光性：由绿变红是在无光条件下化学氧化而成。不过，曝光可促使荧光性发生变化。

光电转换的可能性：有，在绿光（值为～570纳米）的曝光下转换范围为583纳米至595纳米。570纳米光的曝光可降低红色荧光性。

在科学家描述的首批红色荧光色素中红色荧光蛋白是其中之一。有趣地是，这一色素是从莫斯科一珊瑚水族馆里的一种香菇珊瑚克隆而来。

在已知的4个色素类群（A-D）中，鱼缸里常见的珊瑚中（一些鹿角珊瑚、蔷薇珊瑚、滨珊瑚、蕈珊瑚和刺孔珊瑚），至少一类海葵（玫瑰海葵）里及各种六放珊瑚中都发现了红色荧光蛋白色素。

这种荧光团的结构与许多（即便不是全部）非荧光发光团（我们会在单独的文章中陈述非荧光发光团的检测情况）。大家应该注意到红色荧光蛋白的荧光性并非全由化学氧化而成。——某些红色荧光蛋白色素对光能有反应（特别是蓝光，我们将在下文看到这方面内容）。因为红色荧光蛋白具有B类群的特性（这一类群还包含在一些微孔珊瑚及一种尚未识别的蔷薇珊瑚中），所以至少某些石珊瑚的色素成熟方式是相同的。

荧光团结构重组导致着色转变（一个荧光团就是一个含有荧光物质的“包裹”）。从绿到红的过渡是自动催化的（虽然光能可导致红化）。可是，某些绿色色素向红色转变失败却看不见绿色着色，因为发射值为583纳米的红色色素吸收了绿色色素发射的光。在某些情况下，红色荧光性会丢失，因为绿色荧光性不再被红色色素吸收，珊瑚就会表现为绿色（见图3）。

图3. 红色荧光蛋白最强有力地吸收绿光并发射荧光——如橙光/红光

图4. 与图2中相同的香菇珊瑚——它已经丢失了红色。在底部礁石上的红色是水溶性叶绿素荧光的颜色。激发光是“黑光”（不可见光）。

红色荧光色素561

宿主：精巧石芝珊瑚

色素名称：Kusabira Orange

色素类群：C1

色素种类：红色荧光蛋白

激发值/发射值：分别为548纳米/561纳米

诱发荧光性最好的是：？

要求的光照强度：？

图5.一种香菇珊瑚（蕈珊瑚）的橙色荧光性。

图片由史蒂夫·鲁迪和www.coralreefecosystems.com网站提供

图6.Kusabira-Orange的激发和发射光谱

图7.来自蕈珊瑚样本（见图5）的色素带有荧光色素，其荧光峰值位于光谱的橙色区域，肩峰值为～600纳米。～680纳米的荧光是由共生性虫黄藻中的水溶性叶绿素导致的。～430纳米的表面荧光是激发源的假象。

描述为红色C1类群的只有Kusabira-Orange（绿色C1色素有一对（几个））。通过在不同光照强度条件下地观察，人工环境中容易保持该色素的荧光性。有趣的是，在蕈珊瑚圆盘的底部该色素很明显。

既然这种颜色如此容易保持（甚至在珊瑚色彩较暗的底部都非常显眼），我想说这一色素是由那些不受爱好者们控制的因素导致的结果（如：化学氧化）。

红色荧光色素572

宿主：指状蔷薇珊瑚

色素类群：未知（可能是C3）

色素种类：红色荧光蛋白

激发/发射值：分别为556纳米/～572纳米

诱发荧光性最好的是：蓝光

要求的光照强度：400微摩尔每平方米每秒以达到最好的荧光性

光电转换可能性：在某些橙色蔷薇珊瑚中存在可能性

与文章之前描述的色素一样，这种色素在人工环境中也非常容易保持（如下文列出的另外几种蔷薇珊瑚色素）。研究者将蓝光向光谱的绿色区间加强，发现当珊瑚受蓝光照射时橙色着色就会显现。红光对该色素的表现力有显著效果（虽然与“蓝”和“绿”光相比红光的效果仍然很低）

图8. 指状蔷薇珊瑚的橙色荧光性。这种色素在蔷薇珊瑚中很常见。图片由作者提供。

图9. 光合成有效辐射（PAR）及其对荧光色素衍生的影响。丹吉洛等人，2008。

图10. 光色对着色的影响——注意“绿”光对由珊瑚虫产生的色素有显著影响。一次处理标准是200毫摩尔每平米每秒。丹吉洛等人，2008.

图11. 来源于石珊瑚指状蔷薇珊瑚的橙色色素的激发和发射特征。水溶性叶绿素的峰值在680纳米左右。马泽尔，未公布的数据。

图12. 一个水族馆里的指状蔷薇珊瑚（见图8）的荧光性。它的光谱特征与图11、13、15、17、19中珊瑚的光谱特征几乎相同。

图13. 又一个水族馆里的长大了的指状蔷薇珊瑚荧光性测量结果。虽然发射值走势与这节中另外两个相似，但其发射峰值为577纳米（相对于575纳米）。这真得重要吗？可能不。

其他蔷薇珊瑚的色素

除了非荧光色素蛋白，目前没有证据显示蔷薇珊瑚含有除红色荧光蛋白类型之外的任何类似绿色荧光蛋白的蛋白质。

图14. 叶盘形蔷薇珊瑚的橙色荧光性（?)。图片由作者提供。

图15. 光谱仪显示荧光峰值为575纳米。

图16. 一种尚未确认的蔷薇珊瑚，其橙色荧光性在此类珊瑚中很具有代表性。图片由作者提供。

图17. 这种尚未确认的蔷薇珊瑚的荧光光谱特征。

图18. “落日”蔷薇珊瑚，它的红色荧光蛋白类的橙色荧光，并且，在它的水螅体中有绿色荧光色。注意水螅体初期的成长——其触手是橙色的而口部圆盘是青色的。这种色素转变为绿色荧光蛋白类的橙色荧光蛋白了吗？图片由作者提供。

图19. 再者，这种特别的蔷薇色素发射值与上面一些图片所显示的珊瑚色素发射值几乎一样。

一个蔷薇类珊瑚的绿变红光电转换案例

非常感谢史蒂夫·鲁迪（www.coralreefecosystems.Com）分享此信息——他提供了一类蔷薇珊瑚（行业俗称"Pokerstar（扑克星- -？）" 蔷薇珊瑚）由绿转红的照片记录。我倾向的是色素转变由光质决定，但这还有待确认。请看图20及图21图片说明中详细的照明设置。

图20. 该"Poker Star"蔷薇珊瑚保持在150w（瓦）色温20+k（开尔文）的氙灯照射下。照片由史蒂夫·鲁迪及www.coralreefecosystems.com网站提供。

图21. 该片段来源于图19中的那个蔷薇珊瑚，不过位于不同灯的照射下。我们可以看到水螅体颜色从绿向红转变。照片由史蒂夫·鲁迪及www.coralreefecosystems.com网站提供。灯具有：250w（瓦）20,000K（开尔文）镭射灯，150w 50,000k日本岩崎灯，1-160w VHO（高输出功率）UVL（欠压保护）"Super Actinic"（‘超级光化’）灯以及1-160w UVL "Actinic White"（光化白色）灯。

红色荧光色素576

宿主：纽扣珊瑚

色素类群：类群C，可能是C3

色素种类：红色荧光蛋白

激发/发射值：分别为552纳米/576纳米

诱发荧光性最好的是：？

要求的光照强度：？

光电转换可能性：？

图22. 来自纽扣珊瑚的橙红色荧光色素。

红色荧光色素593

宿主：多孔鹿角珊瑚

色素类群：C3

色素种类：红色荧光蛋白

激发/发射值：分别为560纳米/593纳米

诱发荧光性最好的是：？

要求的光照强度：？

光电转换可能性：有可能

有关鹿角珊瑚色素中这类色素的所有可用信息都列出了。我们知道这一特殊色素肯定是红色荧光蛋白类，且色素类群是C3。

多孔鹿角珊瑚的另一类色素（FP-594）从红色向绿色（535纳米）转变需要488纳米的蓝光照射。请看下面给出的另一种（可能有着密切联系的）鹿角珊瑚的附加数据。

红色荧光色素597

宿主：多孔鹿角珊瑚

色素类群：可能是C3

色素种类：红色荧光蛋白

激发/发射值：分别是558纳米/597纳米

诱发荧光性最好的是：蓝光

要求的光照强度：400微摩尔每平方米每秒以达到最好的荧光性

光电转换可能性：就水族馆里的样本来说，有可能

图23. 一种色彩美丽的多孔鹿角珊瑚。绿色荧光性的初始状态及它向红色荧光（加上表面呈黄橙着色的绿红色彩混合）转变过程为我们看到得大部分着色做出说明。但是，这还有待确认。图片由Justin Miedwig和madfragsonline.com网站提供。

图24. 光合成有效辐射（PAR）及其对荧光色素衍生的影响。丹吉洛等人，2008.

图25. 光色对着色的影响。一次处理标准是200毫摩尔每平米每秒。与所有被测试的色素一样，蓝光诱导其荧光着色表现效果明显。丹吉洛等人，2008.

红色荧光色素611

宿主：奶嘴海葵

色素类群：A

色素种类：红色荧光蛋白

激发/发射值：分别为611纳米

诱发荧光性最好的是：化学氧化

要求的光照强度：无

光电转换可能性：无

图26. 气泡尖，或玫瑰海葵（奶嘴海葵）。照片由史蒂夫·鲁迪及www.coralreefecosystems.com网站提供。

图27. 气泡尖海葵（奶嘴海葵）中发射峰值为611纳米的荧光色素。

水族馆管者应注意这种特殊色素对温度敏感。请将水族箱温度保持在摄氏27度以下（华氏81度）。

其他可能为红色荧光蛋白类的色素

此时，看上去远红荧光色素可能属于红色荧光蛋白类（他们的光谱特征和其他的红色Kaede(枫）型色素不相匹配。我们会其他文章中单独讨论Kaede型色素）。

多芬等人（2001）报告了一种发射值发射值分别为610纳米（来自Montipora monasteriata，类群未知），625纳米（来自细枝鹿角珊瑚，类群未知）的色素，荧光发射值为625纳米（来自Acropora horrida，类群C3？）的另一种色素，还有一种来自 Porites murrayensis的色素发射值仍为625纳米（类群B？）。

红色荧光色素620

宿主：蔷薇珊瑚

色素类群：B

色素种类：红色荧光蛋白

色素名称：Keima-Red

激发/发射值：分别为440纳米/620纳米

诱发荧光性最好的是：？

要求的光照强度：？

光电转换可能性：未知

Keima日语中的意思是“骑士”——研究者根据这种蛋白质的发射值走势命名，其走势与棋子骑士的走法类似。有趣的是，Montipora efflorescens和Porites porites转变后的远红荧光色素类群也是B（当然，这一类群还包括来自coralliimorpharian Discosoma（拟珊瑚海葵属香菇珊瑚）中红色荧光蛋白的原始红色荧光色素）。

不像色素611（发现于anemone E.Quadricolor(海葵属奶嘴海葵）），色素620在高温下（摄氏37度，或华氏98.6度）状态稳定。

图28. 注意这种蔷薇珊瑚色素惊人的斯托克司频移。

红色荧光色素620

宿主：Porites astreoides

色素类群：未知，可能是B

色素种类：红色荧光蛋白

激发/发射值：分别为～580纳米/620纳米

诱发荧光性最好的是：？

要求的光照强度：？

光电转换可能性：未知

图29. 该色素可能属于B类群的红色荧光蛋白类荧光色素。

人们已经开始注意这一来自Porites porites （微孔珊瑚）的色素(激发值578纳米，发射峰值595纳米）。它一个B类群的红色荧光蛋白类色素。

红色荧光色素630

宿主：Acropora aspera

色素类群：未知（可能是C3？）

色素种类：红色荧光蛋白（？）

激发/发射值：分别为～575纳米/620纳米

诱发荧光性最好的是：？

要求的光照强度：？

光电转换可能性：未知

荧光色素630在被称为“珊瑚色”色素里最接近于红色色素的。所有已知的来自Acropora(鹿角珊瑚属)的红色色素都是C3类群，因此此色素暂时被归入这一类群。此信息来源于侯赛因等人（2001）。

图30. 来自stony coral Acropora aspera的“超红”色素

评论

总体上，人工环境中红色荧光蛋白色素的荧光性不难保持。虽然程度各有不同，但我们已经确定在色彩提升过程中光（特别是蓝光）十分重要。在某些案例中绿光可以提高着色，单一的红光可让珊瑚轻微显现着色。

在一些案例中，温度是至关重要的（例如在rose or bubble-tip anemone-E.Quardricolor玫瑰色或气泡尖海葵——奶嘴海葵中所见的），温度在摄氏27度以上（华氏～81度）会抑制着色。而另一方面蔷薇珊瑚中的Keima 色素在摄氏37度（华氏98.6度）下状态稳定。

我们还了解了金属可帮助提升或抑制着色。与蛋白质粘合在一起的金属肯定影响珊瑚着色，但是还不清楚那些提高荧光性的金属是必要的辅助因素还是仅仅是粘合的产物。

至此你可能意识到，这一课题是我的兴趣所在，我将对此课题进行持续研究。下次，我们来看看“其他的”红色色素——"Kaede"型色素。

鸣谢

非常感谢史蒂夫·鲁迪（www.coralreefecosystems.Com），Justin Miedwig及（www.madfragsonline.com)网为此文提供照片和信息。还有，谢谢查尔斯·马泽尔博士（www.nightsea.com)记着我对珊瑚着色的痴迷，并提供我一份丹吉洛的论文。

特别感谢鱼友桑迪·舒普，她那些有关蔷薇珊瑚着色变化的问题难住了我（两次）。桑迪，我希望这篇文章能阐明一些有关珊瑚着色的问题。

还有问题？意见？请电邮我，邮箱地址RiddleLabs@aol.com.

参考文献

1 Baird, G., D. Zacharias and R. Tsein, 2000. Biochemistry, mutagenesis, and oligomerization of DsRed, a red fluorescent protein from coral. Proc. Natl. Acad. Sci., 97, 22:11984-11989.

2 D'Angelo, C., A. Denzel, A. Vogt, M. Matz, F. Oswald, A. Salih, G. Nienhaus, and J. Wiedenmann, 2008. Blue light regulation of host pigment in reef-building coral. Mar. Ecol. Prig. Ser. 364: 97-106.

3 Eli, P. and A. Chakrabartty, 2006. Variants of DsRed fluorescent protein: Development of a copper sensor. Protein Sci. 15(10):2442-2447.

4 Rahimi, Y., A. Goulding, S. Shrestha, S. Mirpuri and S. Deo, 2008. Mechanisms of copper induced fluorescence quenching of red fluorescent protein, DsRed. Biochem. Biophys. Res. Comm., 370(1):57-61.